Si bien la criopreservación garantiza la supervivencia de los espermatozoides, una elevada y variable proporción del proceso de congelación-descongelación afecta la integridad de la membrana plasmática (MP) y acrosomal (MA) tanto en lo referente a la morfología como a la funcionalidad, lo cual suele ocasionar daños irreversibles y causar muerte celular e infertilidad.   Se ha demostrado como los espermatozoides de  diferentes toros evaluados, resisten de manera distinta los efectos lesivos de la criopreservación, de manera indiscriminada sobre la integridad estructural y funcional MP y MA, lo que afecta la capacidad fecundante de las muestras seminales destinadas a IA.  

Por lo tanto el éxito de la  criopreservación del semen depende de varios factores que interactúan entre sí como el criprotector, tipo de diluyente, tasa de enfriamiento, tasa de descongelación y empaque, así como la variación individual del reproductor.  

Es inevitable que se presente perdida de la viabilidad del espermatozoide debido a su manejo antes del proceso de  congelación así como durante el proceso mismo, por lo que el éxito de la criopreservación  se mide por la capacidad de mantener su capacidad fecundante después de la descongelación. Para lograr lo anterior debe mantener su capacidad para producir energía mediante el metabolismo, mantener la configuración e integridad de la membrana plasmática, retener su motilidad y conservar las enzimas, como la acrosina, dentro del acrosoma para permitir la penetración del  ovocito.  

El  semen después de refrigerado a 5-8°C sobrevive por 24-48 horas y aún 96 horas sin que haya disminución del porcentaje de fertilidad. En la actualidad la técnica congelación se ha estandarizado y el semen se almacena indefinidamente en nitrógeno líquido a -198°C, manteniendo una fecundación aceptable en las tasas de fertilización luego de la descongelación. Generalmente, la viabilidad del esperma disminuye un 50% por efecto de la criopreservación al afectar varios de los organelos espermáticos, la inducción prematura de la reacción acrosómica, alteración de la función mitocondrial, reducción de la motilidad y fallas en la decondensación de la cromatina.  

Otro frente de investigación en la última década ha sido el de desarrollar métodos que permiten examinar las características ultraestructurales del esperma y sus alteraciones, entre las que se encuentra la prueba de kinética del esperma para análisis de la motilidad mediante asistencia computarizada (Computer Assisted Semen Analysis (CASA), prueba de resistencia osmótica (hypo-osmotic swelling test HOST), evaluación de la integridad y permeabilidad de la membrana plasmática mediante colorantes fluorescentes, evaluación del estado acrosomal con lectinas fluoresceína isocianato conjugado, investigación de la integridad del ADN utilizando SCSA (Chromatin Structure Assay Test SCSA) o evaluación del estado de la arquitectura membranosa.   El empleo de una combinación de pruebas en lugar de una sola prueba, puede conllevar a obtener una información más completa sobre el estado del espermatozoide. Las pruebas dirigidas a evaluar la integridad de la estructura cromática del esperma son capaces de identificar los defectos espermáticos que normalmente no se detectan durante los análisis convencionales del semen. Los métodos requieren de la aplicación de microscopio fluorescente y/o técnicas de citometría de flujo, por lo que por su alta cantidad, repetitibilidad y sensibilidad ya se desarrollan en muchas centrales modernas de reproducción asistida.     Manejo del semen a criopreservar   Después de determinar la  fertilidad del reproductor, puede tomarse la decisión de recolectar muestras de semen para la producción de pajillas con destino al programa de inseminación. Con posterioridad a la evaluación de la calidad del semen y realizar el cálculo de la concentración espermática, es importante determinar la cantidad de Espermatozoides con Motilidad progresiva Morfológicamente Normales (MPMN) en el eyaculado. El número de MPNM será utilizado para calcular el número de dosis que pueden ser congeladas.  

En el ejemplo siguiente se muestra la forma a seguir para calcular el número de dosis y dilución de una muestra de eyaculado. La existencia de numerosas fuentes de variación de la fertilidad (toro, eyaculado, número de espermatozoides, hembra, etc.) impone que el centro de inseminación artificial deba incluir en la dosis de semen congelado  un número de espermatozoides bastante elevado. Cuando se utilizan 20 millones de espermatozoides/dosis, un porcentaje de motilidad progresiva de 30 a 50% a la hora de cero postdescongelación, permite disponer de entre 6 a 10 millones de células espermáticas con motilidad progresiva/dosis. El profesional puede solicitar o considerar cual es la concentración deseada por pajilla.   La CSS tiene aprobados dos protocolos para la dilución  del  semen bovino, que son: 1. El protocolo Estandar CSS que es un método de dos pasos. 2. El protocolo Alternativo CSS que es un método de un paso. 3. El Protocolo Estandar CSS es usado en los Estados Unidos y requiere de dos pasos. Los diluyentes más comúnmente utilizados en este protocolo tienen como amortiguadores el Tris (hidroximetil-aminometano) o el Citrato de sodio. 4. Requieren de yema de huevo para proteger las células espermáticas contra el shock térmico por frío y vienen presentados comercialmente con dos fracciones (A y B) y una mezcla de antibióticos. La Fracción B es similar a la Fracción A, excepto que contiene 14% de glicerol como crioprotector. 5. El protocolo de dos pasos logra una concentración final de 20% de yema de huevo, 7% de glicerol, 50 μg de Tilosina, 250  μg de Gentamicina, 150  μg de Lincomicina y 300  μg de estreptomicina por cada ml de semen diluido y congelado.

Técnica de dilución del semen   Los antibióticos se adicionan cuidadosamente al semen puro en una proporción de 0.02 ml de la mezcla de  por cada ml de semen. Los antibióticos deben estar en contacto por 3 a 5 minutos con el semen puro, antes de proseguir la dilución. En un matraz o tubo de ensayo de 50 ml. se diluye el semen con antibióticos, con un pequeño volumen de Fracción A precalentada. Dependiendo del número calculado de pajillas  a procesar, el eyaculado debe luego diluirse con más Fracción A hasta completar el 50% del volumen de diluyente total a usar. La Fracción A del diluyente debe tener la misma temperatura del semen al momento de mezclarse (20-32°C)  

Enfriar el semen diluido lentamente durante un período mínimo de dos horas hasta llegar a 4°C. Para realizar este paso, el recipiente con el semen diluido debe dejarse enfriar hasta temperatura ambiente y luego se coloca en un refrigerador a 4°C. Nota: 300 ml de líquido con temperatura de 30° a 35°C disminuyen su temperatura hasta 4°C en un período aproximado de 2 horas.   La segunda mitad del volumen total de diluyente corresponde a la Fracción B que contiene glicerol, la cual debe estar pre-enfriada a 4°C. El volumen de Fracción B se adiciona gradualmente al semen ya extendido con Fracción A durante un período de 30 minutos hasta alcanzar una proporción 1:1. El volumen final de semen completamente extendido contendrá una concentración final de 7% de Glicerol.  

El semen completamente  diluido debe tener un período de equilibrio a 4°C por un mínimo de 4 horas. Este tiempo puede ser usado para llenar y sellar las pajillas y ubicarlas sobre las gradillas de congelación y conteo e iniciar la curva de frío lenta.  

El Protocolo Alternativo es un método de un paso. Es el método más empleado en Europa. Está aprobado para ser utilizado con Tris (hididroximetilamiometano) como amortiguador y requiere la adición de 20% de yema de huevo. El diluyente  no está  fraccionado y contiene 7% de Glicerol más antibióticos. El protocolo produce una concentración de 100 μg de Tilosina, 500 μg de Gentamicina 300 μg de Lincomicina y 600 μg de Estreptomicina por cada ml de semen diluido y congelado.     Técnica de dilución del semen   Igualar la temperatura del diluyente con la temperatura del semen, ubicando ambos componentes dentro de un baño maría a una temperatura de 28 a 32°C, Los antibióticos deben mantenerse a la misma temperatura.  

Los antibióticos son adicionados cuidadosamente al semen puro en una proporción de 0.02 ml de la mezcla por cada ml de semen. Los antibióticos deben estar en contacto por 3 a 5 minutos con el semen puro, antes de proseguir con la dilución. En un matraz o tubo de ensayo de 50 ml, se diluye inicialmente el semen con los antibióticos, con un pequeño volumen de diluyente, en forma lenta. Dependiendo del número de pajillas a procesar, prosiga la dilución del semen hasta alcanzar el volumen total de dilución. Enfriar lentamente el semen diluido durante un período mínimo de 2 horas hasta llegar a 4°C y continúe el proceso como en el protocolo estandar. Durante la preparación de los diluyentes se puede utilizar un agitador magnético para asegurar su dilución y mezcla. Después del proceso de mezclado se puede o no filtrar el diluyente. Una vez realizada la dilución se continúa con el marcado, llenado y sellado de las pajillas. Este proceso puede efectuarse a temperatura ambiente o después de entrar la dilución del semen a 4°C, de manera manual o computarizada. Actualmente se utilizan pajillas de 0.25 y 0.5 ml.   Después del llenado, las pajillas se sellan manualmente con polvo de polivinilo, selladores térmicos o por ultrasonido, esferas metálicas o de vidrio, dependiendo del equipo empleado. Una vez empacado el semen, se debe llevar a cabo una curva de enfriamiento lenta, la cual se inicia con la refrigeración de equilibrio a 4°C en un período de 4 horas. Luego se procede a la congelación del semen en pajillas mediante el sistema de vapor de nitrógeno líquido a -120 °C, colocando las gradillas con las pajillas a 4 cm sobre el nivel de nitrógeno, contenido en el recipiente para tal efecto, manteniéndose por al menos 10 minutos. Enseguida las gradillas se introducen directamente en el nitrógeno líquido para ser conservadas a -180°C o 196°C. El proceso de congelación en centrales de reproducción se efectúa en equipos computarizados. Con este sistema existe la opción de congelar un número mínimo, hasta miles de pajillas en un solo paso, en forma  confiable y exacta. Las congelaciones computarizadas ofrecen posibilidades ilimitadas para almacenar diferentes programas de congelación, utilizando tasas de congelación desde 0.01 hasta 60°C/minuto, con una exactitud máxima y en rangos de temperatura desde +40°C a -180°C.   Después del proceso de congelación se trasfieren las pajillas a  termos de almacenamiento con nitrógeno líquido, usados para distribución y comercialización del semen congelado. Es importante evaluar los lotes de pajillas luego de su descongelación, para darles el visto bueno y calificarlas como aptas para inseminación o rechazarlas. En un próximo artículo trataré el tema de la evaluación del semen congelado